产品简介
血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF），又称血管通透因子（Vascular Permeability Factor, VPF），是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。肿瘤新血管的生成是在血管内皮生长因子的调控下进行和完成的。肿瘤血管新生的活跃程度是影响肿瘤细胞增殖的重要因素，而VEGF是肿瘤血管生成最重要的促进因子之一，故它可反映肿瘤的发生、发展和归转。通过测量血清中VEGF的含量，可以达到肿瘤早期筛查、肿瘤病人治疗的疗效观察与复发监测以及其他与血管新生相关疾病的辅助诊断、监测与评价。Human VEGF ELISA Kit通过双抗体夹心酶联免疫吸附技术，体外定量检测人血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清或其它相关液体中的VEGF，可同时检测天然的和重组的人VEGF。
储存与运输
冰袋运输；4℃保存，有效期12个月；开封后需在4周内用完。
需准备的材料设备
1. 能够检测450 nm吸光度的酶标仪，参考波长630 nm（建议参考仪器使用说明提前预热）；
2. 单道或多道移液器及吸头，加样槽，离心管；
3. 蒸馏水或去离子水；
4. 干性滤纸或吸水纸；
5. 涡旋混匀仪，微孔板振荡器。
样本的采集与保存
1. 血清样本：采集血样，静置30分钟，血液凝固。取液体部分进行离心分离，1000 g离心15分钟，吸取上清即可检测，或者分装，分装上清置于-20℃以下保存，避免反复冻融。
2. 血浆：用EDTA、枸橼酸钠或肝素作为抗凝剂收集血浆样本，并将样本在采集后的30分钟内于2-8℃1000 g离心15分钟，吸取上清即可检测，或者分装，分装上清置于-20℃以下保存，避免反复冻融。
3. 组织匀浆：组织块用预冷PBS洗涤，去除血污，称重后剪成细小碎块置于匀浆器中。加入10倍组织重量的PBS匀浆，得到的匀浆液经过超声处理至澄清。将制备好的匀浆液12000 g离心5分钟，弃沉淀，吸取上清即可检测，或者分装，分装上清置于-20℃以下保存，避免反复冻融。
4. 细胞裂解液
a) 对于贴壁细胞样品：先用PBS清洗细胞2-3次，最后一次彻底吸干残留液体。按照6孔板每孔细胞250 μL裂解液的比例吸取细胞裂解液于细胞培养板、瓶内，反复晃动培养板、瓶，使裂解液与细胞充分接触3-5分钟。用细胞刮刀将细胞刮下，收集到离心管中。12000 g离心5分钟，吸取上清即可检测，或者分装，分装上清置于-20℃以下保存，避免反复冻融。
b) 对于悬浮细胞样品：离心收集细胞，按照6孔板每孔细胞250 μL裂解液的比例将细胞液与细胞裂解液混合，振荡。冰浴30分钟，期间每10分钟用移液器反复吹打数次，确保细胞完全裂解。12000 g离心5分钟，吸取上清即可检测，或者分装，分装上清置于-20℃以下保存，避免反复冻融。
5. 细胞培养上清：300 g离心10分钟，吸取上清即可检测，或者分装，分装上清置于-20℃以下保存，避免反复冻融。
注意：
1. 样本如果浑浊，必须离心去除沉淀物，不适用严重溶血或高血脂的样本。
2. 以上样本均需密封保存，4℃保存不超过1周，-20℃保存不超过1个月，-80℃保存不超过2个月。
3. 冷冻样本使用前应缓慢平衡至室温。
试剂的配制
1. 提前20分钟将试剂盒及样本从冰箱中取出，平衡至室温。按实验需求取出本次实验所需板条和试剂，每次检测后剩余试剂请及时置于4℃保存。
2. 1×洗液配制：取25×浓缩洗液30 mL至1 L的量筒，加蒸馏水或去离子水至750 mL，轻轻混匀。转移至干净瓶内。
3. 标准品配制：将稀释液A按照标签标注体积加入标准品中，轻柔涡旋振荡，确保充分混匀。重溶后的标准品浓度为4000 pg/mL，即为浓缩的人VEGF标准品。重溶后静置10分钟，稀释前充分混匀。
a) 血清/血浆/组织匀浆/细胞裂解液样本标准曲线制备：
充分混匀重溶后的标准品，取500 µL浓缩的人VEGF标准品，加入500 µL稀释液A，作为标准曲线的最高浓度S7（2000 pg/mL）。取6个1.5 mL离心管（S1-S6）依次排列，各加入500 µL稀释液A。吸取500 µL S7（2000 pg/mL）标准品到第一个离心管S6中，轻轻吹打混匀。从S6中吸取500 µL到第二个离心管S5中，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。S0为稀释液A。
b) 细胞培养上清样本标准曲线制备：
充分混匀重溶后的标准品，取500 µL浓缩的人VEGF标准品，加入500 µL细胞培养基，作为标准曲线的最高浓度S7（2000 pg/mL）。取6个1.5 mL离心管（S1-S6）依次排列，各加入500 µL细胞培养基。吸取500 µL S7（2000 pg/mL）标准品到第一个离心管S6中，轻轻吹打混匀。从S6中吸取500 µL到第二个离心管S5中，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。S0为细胞培养基。
4. 1×检测抗体配制：检测抗体短暂离心，用稀释液B按照1:100倍稀释至工作浓度。混匀制成1×检测抗体工作液，临用前配制。
5. 1×SA-HRP配制：SA-HRP短暂离心，用稀释液B按照1:100倍稀释至工作浓度。混匀制成1×SA-HRP工作液，临用前配制。
注意：
1. 未开封的试剂盒：未拆封的试剂盒可整盒保存于4℃，有效期12个月。
2. 已开封的试剂盒：有效期4周，冻干标准品溶解后不能再次使用，剩余试剂及时放置4℃保存。此外，请将未使用的板条用包含干燥剂的铝箔袋装好，并拉紧密封铝箔袋，置于4℃保存。
操作步骤
1. 加样：分别设标准孔、待测样本孔、空白孔。用稀释液A稀释标准品及样本，设标准孔7孔（S1-S7），每孔依次加入100 μL不同浓度的标准品，空白孔每孔加入100 μL稀释液A，余孔每孔加入待测样品100 μL，封板膜封板，100-300 rpm振荡（保证每孔溶液不洒出且能充分混匀即可），室温振荡孵育2小时；
注意：请先查阅相关文献确定样本中待检测蛋白的大致浓度，如果该浓度大于或者小于本试剂盒的最高或者最低标准品浓度，请进行适当稀释或浓缩后再检测。
2. 洗板：自动洗板或手工洗板，每孔洗涤液为300 μL，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将酶标板倒扣在吸水纸上适当用力拍干，弃去孔内液体；
3. 加检测抗体：用稀释液B将检测抗体稀释至工作浓度，每孔加1×检测抗体工作液100 μL（临用前配制），更换新的封板膜封板，100-300 rpm振荡（保证每孔溶液不洒出且能充分混匀即可），室温振荡孵育1小时；
4. 洗板：重复步骤2；
5. 加SA-HRP：用稀释液B将SA-HRP稀释至工作浓度，每孔加1×SA-HRP工作液（临用前配制）100 μL，更换新的封板膜封板，100-300 rpm振荡（保证每孔溶液不洒出且能充分混匀即可），室温振荡孵育30分钟；
6. 洗板：重复步骤2；
7. 加显色液TMB：每孔加TMB底物溶液90 μL，更换新的封板膜，室温避光显色（反应时间应控制在10-30分钟，不要超过30分钟。当标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）；
8. 加终止液：每孔加终止溶液50 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不均一情况，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀；
9. 读数：在确保酶标板底部无水滴及孔内无气泡后，10分钟内用检测波长450 nm读值。推荐用双波长即检测波长450 nm、参考波长或校正波长630 nm同时读值，仅使用450 nm读值会降低准确度。
注意事项
1. 试剂盒按说明书保存，使用前室温平衡20-30分钟。
2. 标准品为冻干粉，所需加入的稀释液体积及稀释倍数，请严格按照试剂盒说明书进行操作。为保证标准品的精确性，标准品配制使用后，如果有剩余请勿再次使用。
3. 25×洗液在低温下可能有结晶，如果发现有结晶，请37℃温育使结晶完全溶解后再配制成工作液。
4. TMB对人体有刺激性，操作时请注意适当防护，避免试剂直接接触皮肤和眼睛。如不慎接触，请立即用大量清水清洗。
5. 试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作时请注意适当防护，避免试剂直接接触皮肤和眼睛。如不慎接触，请立即用大量清水清洗。
6. 如果发现显色液TMB出现混浊或颜色变成蓝色，请立即停止使用。
7. 不宜混用不同批号的试剂盒组份，每批次试剂盒均经过独立测试，不能混用。
8. 本试剂盒的操作在室温进行，要求严格控制室温在25-28℃。温度低于25℃会导致最终检测到的吸光度显著下降。
9. 检测标准品和样品时建议设置重复孔，以确保检测结果的可信度。
10. 在试剂盒的贮存或孵育过程中请避免强光照射。
11. 加样过程中需避免气泡的产生。
12. 在操作试剂盒或处理样本时请穿实验服，佩戴乳胶或一次性手套。
13. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅。
14. 为了避免微生物的污染及试剂与样本间的交叉污染，加样时请注意每个样品或标准品必须更换枪头。
15. 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，滤纸上看不到水印。勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。
结果分析
1. 结果计算
为了获得更准确的实验结果，建议标准品及样本进行复孔检测。计算标准品和样本的平均OD值，然后减去空白孔的OD值。
以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用计算机软件进行回归拟合生成标准曲线，相关系数R值越接近1，拟合效果越好。回归分析确定最佳拟合曲线。
代入样本检测OD值，计算出样本浓度，若样本进行了稀释，应乘以稀释倍数，即为样本的实际浓度。
通过对浓度值和OD值取对数拟合，可以对标准曲线进行线性化。此过程可能可以得到更多样本的浓度，但数据的准确度会降低。
2. 典型数据
每次检测每块酶标板都必须设立单独的标准曲线。由于实验操作条件的不同（如操作者、洗板条件和温度条件等），每次实验标准曲线的OD值会有所差异。说明书提供的标准曲线仅供参考。
3. 灵敏度
人VEGF的最低可检测浓度为4.71 pg/mL(3次独立实验的平均值)。
此值为20个空白孔测定的平均OD值加上两倍SD所对应的浓度值。
4. 精密度
精密度用样品测定值的变异系数CV表示。变异系数CV（%）=（标准偏差SD/平均值Mean）×100；
批内差：3个已知浓度的高、中、低样本在同一批次酶标板内重复测定20次，评估酶标板内的精密度。批内差：CV<8%。
批间差：3个已知浓度的高、中、低样本在3个不同批次的试剂盒间重复测定8次，评估酶标板间的精密度。批间差：CV<10%。
5. 回收率
于5份定值人血清中加入一定量的人VEGF（加标样品），重复测定并计算其均值，未加人VEGF的血清作为本底，计算回收率（回收率为测定值与理论值的比率）。回收率的范围从88%至112%，平均回收率104%。
6. 稀释线性
于5份定值人血清中加入适量的人VEGF（加标样品），并在标准曲线的动力学范围内进行系列稀释，评估检测的线性。线性范围即为稀释后样本中人VEGF含量的测定值与理论值的比率。
7. 样本值
对30例健康志愿者的血清/血浆样本应用本试剂盒进行实验分析，志愿者的用药史不详，所有样本检测值均为阳性。
8. 特异性
本试剂盒用于检测VEGF，可以识别天然和重组的人VEGF，经检测与重组小鼠TNF-alpha，大鼠TNF-alpha，小鼠IFN-gamma，大鼠IFN-gamma等无明显交叉反应。由于受到技术及样本来源的限制，不可能完成所有相关或相似物质交叉反应检测，因此本试剂盒有可能与未经检测的其它物质有交叉反应。
检测步骤概要
1. 实验前按说明书准备标准品、试剂及样本；
2. 加样（标准品或样本）100 μL/孔，室温振荡2小时；
3. 洗涤5次后拍干，加检测抗体工作液100 μL/孔，室温振荡1小时；
4. 洗涤5次后拍干，加SA-HRP工作液100 μL/孔，室温振荡30分钟；
5. 洗涤5次后拍干，加TMB底物90 μL/孔，室温避光孵育10－30分钟；
6. 加终止液50 μL/孔；
7. 10分钟内于450 nm波长处检测OD值，参考波长630 nm。
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