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产品介绍

产品简介

肿瘤坏死因子α(TNF-α)又称为恶病质素或TNFSF1A,是一种脂肪因子,主要由巨噬细胞和单核细胞分泌,参与正常炎症反应和免疫反应。主要作用是调节免疫细胞的功能。作为一种内源性致热原,它能够促使发热,引起细胞凋亡,引发败血症,引起恶病体质,阻止肿瘤发生和病毒复制。肿瘤坏死因子α生产的失调与许多疾病有关,包括阿兹海默氏症、癌症和肠炎。肿瘤坏死因子α在病理状态下产生增多,包括败血症、恶性肿瘤、心脏衰竭和慢性炎性疾病。Mouse TNF-alpha ELISA Kit通过双抗体夹心酶联免疫吸附技术,体外定量检测小鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关液体中的TNF-alpha,可同时检测天然的和重组的小鼠TNF-alpha。

 

储存与运输

冰袋运输;4℃保存,有效期12个月;开封后需在4周内用完。
 

需准备的材料设备

1. 能够检测450 nm吸光度的酶标仪,参考波长630 nm(建议参考仪器使用说明提前预热);

2. 单道或多道移液器及吸头,加样槽,离心管;

3. 蒸馏水或去离子水;

4. 干性滤纸或吸水纸;

5. 涡旋混匀仪,微孔板振荡器。

 

样本的采集与保存

1. 血清样本:采集血样,静置30分钟,血液凝固。取液体部分进行离心分离,1000 g离心15分钟,吸取上清即可检测,或者分装,分装上清置于-20℃以下保存,避免反复冻融。

2. 血浆:用EDTA、枸橼酸钠或肝素作为抗凝剂收集血浆样本,并将样本在采集后的30分钟内于2-8℃1000 g离心15分钟,吸取上清即可检测,或者分装,分装上清置于-20℃以下保存,避免反复冻融。

3. 细胞培养上清:300 g离心10分钟,吸取上清即可检测,或者分装,分装上清置于-20℃以下保存,避免反复冻融。

注意:

1. 样本如果浑浊,必须离心去除沉淀物,不适用严重溶血或高血脂的样本。

2. 以上样本均需密封保存,4℃保存不超过1周,-20℃保存不超过1个月,-80℃保存不超过2个月。

3. 冷冻样本使用前应缓慢平衡至室温。

 

试剂的配制

1. 提前20分钟将试剂盒及样本从冰箱中取出,平衡至室温。按实验需求取出本次实验所需板条和试剂,每次检测后剩余试剂请及时置于4℃保存。

2. 1×洗液配制:取25×浓缩洗液30 mL至1 L的量筒,加蒸馏水或去离子水至750 mL,轻轻混匀。转移至干净瓶内。

3. 标准品配制:将稀释液A按照标签标注体积加入标准品中,轻柔涡旋振荡,确保充分混匀。重溶后的标准品浓度为1000 pg/mL,即为浓缩的小鼠TNF-alpha标准品。重溶后静置10分钟,稀释前充分混匀。

a) 血清/血浆样本标准曲线制备:

充分混匀重溶后的标准品,取500 µL浓缩的小鼠TNF-alpha标准品,加入500 µL稀释液A,作为标准曲线的最高浓度S7(500 pg/mL)。取6个1.5 mL离心管(S1-S6)依次排列,各加入500 µL稀释液A。吸取500 µL S7(500 pg/mL)标准品到第一个离心管S6中,轻轻吹打混匀。从S6中吸取500 µL到第二个离心管S5中,轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。S0为稀释液A。

b) 细胞培养上清样本标准曲线制备:

充分混匀重溶后的标准品,取500 µL浓缩的小鼠TNF-alpha标准品,加入500 µL细胞培养基,作为标准曲线的最高浓度S7(500 pg/mL)。取6个1.5 mL离心管(S1-S6)依次排列,各加入500 µL细胞培养基。吸取500 µL S7(500 pg/mL)标准品到第一个离心管S6中,轻轻吹打混匀。从S6中吸取500 µL到第二个离心管S5中,轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。S0为细胞培养基。

 

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4. 1×检测抗体配制:检测抗体短暂离心,用稀释液A按照1:100倍稀释至工作浓度。混匀制成1×检测抗体工作液,临用前配制。

5. 1×SA-HRP配制:SA-HRP短暂离心,用稀释液B按照1:100倍稀释至工作浓度。混匀制成1×SA-HRP工作液,临用前配制。

注意:

1. 未开封的试剂盒:未拆封的试剂盒可整盒保存于4℃,有效期12个月。

2. 已开封的试剂盒:有效期4周,冻干标准品溶解后不能再次使用,剩余试剂及时放置4℃保存。此外,请将未使用的板条用包含干燥剂的铝箔袋装好,并拉紧密封铝箔袋,置于4℃保存。

 

 

操作步骤

1. 加样:分别设标准孔、待测样本孔、空白孔。用稀释液A稀释标准品及样本,设标准孔7孔(S1-S7),每孔依次加入100 μL不同浓度的标准品,空白孔每孔加入100 μL稀释液A,余孔每孔加入待测样品100 μL;

2. 加检测抗体:用稀释液A将检测抗体稀释至工作浓度,每孔加检测抗体50 μL。封板膜封板,100-300 rpm振荡(保证每孔溶液不洒出且能充分混匀即可),室温振荡孵育2小时;

注意:

1.步骤1和2尽快完成,前后间隔不超过10min,步骤顺序不能调换

2.请先查阅相关文献确定样本中待检测蛋白的大致浓度,如果该浓度大于或者小于本试剂盒的最高或者最低标准品浓度,请进行适当稀释或浓缩后再检测。

3. 洗板:自动洗板或手工洗板,每孔洗涤液为300 μL,注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将酶标板倒扣在吸水纸上适当用力拍干,弃去孔内液体;

4. 加SA-HRP:用稀释液B将SA-HRP稀释至工作浓度,每孔加1×SA-HRP工作液(临用前配制)100 μL,更换新的封板膜封板,100-300 rpm振荡(保证每孔溶液不洒出且能充分混匀即可),室温振荡孵育30分钟;

5. 洗板:重复步骤3;

6. 加显色液TMB:每孔加TMB底物溶液90 μL,更换新的封板膜,室温避光显色(反应时间应控制在10-30分钟,不要超过30分钟。当标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显时,即可终止);

7. 加终止液:每孔加终止溶液50 μL,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不均一情况,请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀;

8. 读数:在确保酶标板底部无水滴及孔内无气泡后,10分钟内用检测波长450 nm读值。推荐用双波长即检测波长450 nm、参考波长或校正波长630 nm同时读值,仅使用450 nm读值会降低准确度。

 

注意事项

1. 试剂盒按说明书保存,使用前室温平衡20-30分钟。

2. 标准品为冻干粉,所需加入的稀释液体积及稀释倍数,请严格按照试剂盒说明书进行操作。为保证标准品的精确性,标准品配制使用后,如果有剩余请勿再次使用。

3. 25×洗液在低温下可能有结晶,如果发现有结晶,请37℃温育使结晶完全溶解后再配制成工作液。

4. TMB对人体有刺激性,操作时请注意适当防护,避免试剂直接接触皮肤和眼睛。如不慎接触,请立即用大量清水清洗。

5. 试剂盒中的终止液为酸性溶液,操作时请注意适当防护,避免试剂直接接触皮肤和眼睛。如不慎接触,请立即用大量清水清洗。

6. 如果发现显色液TMB出现混浊或颜色变成蓝色,请立即停止使用。

7. 不宜混用不同批号的试剂盒组份,每批次试剂盒均经过独立测试,不能混用。

8. 本试剂盒的操作在室温进行,要求严格控制室温在25-28℃。温度低于25℃会导致最终检测到的吸光度显著下降。

9. 检测标准品和样品时建议设置重复孔,以确保检测结果的可信度。

10. 在试剂盒的贮存或孵育过程中请避免强光照射。

11. 加样过程中需避免气泡的产生。

12. 在操作试剂盒或处理样本时请穿实验服,佩戴乳胶或一次性手套。

13. 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅。

14. 为了避免微生物的污染及试剂与样本间的交叉污染,加样时请注意每个样品或标准品必须更换枪头。

15. 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干,滤纸上看不到水印。勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。

 

结果分析

1. 结果计算

为了获得更准确的实验结果,建议标准品及样本进行复孔检测。计算标准品和样本的平均OD值,然后减去空白孔的OD值。

以标准品浓度为横坐标,OD值为纵坐标,用计算机软件进行回归拟合生成标准曲线,相关系数R值越接近1,拟合效果越好。回归分析确定最佳拟合曲线。

代入样本检测OD值,计算出样本浓度,若样本进行了稀释,应乘以稀释倍数,即为样本的实际浓度。

通过对浓度值和OD值取对数拟合,可以对标准曲线进行线性化。此过程可能可以得到更多样本的浓度,但数据的准确度会降低。

2. 典型数据

每次检测每块酶标板都必须设立单独的标准曲线。由于实验操作条件的不同(如操作者、洗板条件和温度条件等),每次实验标准曲线的OD值会有所差异。说明书提供的标准曲线仅供参考。

 

检测步骤概要

1. 实验前按说明书准备标准品、试剂及样本;

2. 加样(标准品或样本)100 μL/孔,检测抗体50 μL/孔,室温振荡2小时;

3. 洗涤5次后拍干,加SA-HRP工作液100 μL/孔,室温振荡30分钟;

4. 洗涤5次后拍干,加TMB底物90 μL/孔,室温避光孵育10-30分钟;

5. 加终止液50 μL/孔;

6. 10分钟内于450 nm波长处检测OD值,参考波长630 nm。

 

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¥ 1500.00
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LHEM0004-48T

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