产品简介
肿瘤坏死因子α(TNF-α)又称为恶病质素或TNFSF1A，是一种脂肪因子，主要由巨噬细胞和单核细胞分泌，参与正常炎症反应和免疫反应。主要作用是调节免疫细胞的功能。作为一种内源性致热原，它能够促使发热，引起细胞凋亡，引发败血症，引起恶病体质，阻止肿瘤发生和病毒复制。肿瘤坏死因子α生产的失调与许多疾病有关，包括阿兹海默氏症、癌症和肠炎。肿瘤坏死因子α在病理状态下产生增多，包括败血症、恶性肿瘤、心脏衰竭和慢性炎性疾病。Mouse TNF-alpha ELISA Kit通过双抗体夹心酶联免疫吸附技术，体外定量检测小鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关液体中的TNF-alpha，可同时检测天然的和重组的小鼠TNF-alpha。
储存与运输
冰袋运输；4℃保存，有效期12个月；开封后需在4周内用完。
需准备的材料设备
1. 能够检测450 nm吸光度的酶标仪，参考波长630 nm（建议参考仪器使用说明提前预热）；
2. 单道或多道移液器及吸头，加样槽，离心管；
3. 蒸馏水或去离子水；
4. 干性滤纸或吸水纸；
5. 涡旋混匀仪，微孔板振荡器。
样本的采集与保存
1. 血清样本：采集血样，静置30分钟，血液凝固。取液体部分进行离心分离，1000 g离心15分钟，吸取上清即可检测，或者分装，分装上清置于-20℃以下保存，避免反复冻融。
2. 血浆：用EDTA、枸橼酸钠或肝素作为抗凝剂收集血浆样本，并将样本在采集后的30分钟内于2-8℃1000 g离心15分钟，吸取上清即可检测，或者分装，分装上清置于-20℃以下保存，避免反复冻融。
3. 细胞培养上清：300 g离心10分钟，吸取上清即可检测，或者分装，分装上清置于-20℃以下保存，避免反复冻融。
注意：
1. 样本如果浑浊，必须离心去除沉淀物，不适用严重溶血或高血脂的样本。
2. 以上样本均需密封保存，4℃保存不超过1周，-20℃保存不超过1个月，-80℃保存不超过2个月。
3. 冷冻样本使用前应缓慢平衡至室温。
试剂的配制
1. 提前20分钟将试剂盒及样本从冰箱中取出，平衡至室温。按实验需求取出本次实验所需板条和试剂，每次检测后剩余试剂请及时置于4℃保存。
2. 1×洗液配制：取25×浓缩洗液30 mL至1 L的量筒，加蒸馏水或去离子水至750 mL，轻轻混匀。转移至干净瓶内。
3. 标准品配制：将稀释液A按照标签标注体积加入标准品中，轻柔涡旋振荡，确保充分混匀。重溶后的标准品浓度为1000 pg/mL，即为浓缩的小鼠TNF-alpha标准品。重溶后静置10分钟，稀释前充分混匀。
a) 血清/血浆样本标准曲线制备：
充分混匀重溶后的标准品，取500 µL浓缩的小鼠TNF-alpha标准品，加入500 µL稀释液A，作为标准曲线的最高浓度S7（500 pg/mL）。取6个1.5 mL离心管（S1-S6）依次排列，各加入500 µL稀释液A。吸取500 µL S7（500 pg/mL）标准品到第一个离心管S6中，轻轻吹打混匀。从S6中吸取500 µL到第二个离心管S5中，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。S0为稀释液A。
b) 细胞培养上清样本标准曲线制备：
充分混匀重溶后的标准品，取500 µL浓缩的小鼠TNF-alpha标准品，加入500 µL细胞培养基，作为标准曲线的最高浓度S7（500 pg/mL）。取6个1.5 mL离心管（S1-S6）依次排列，各加入500 µL细胞培养基。吸取500 µL S7（500 pg/mL）标准品到第一个离心管S6中，轻轻吹打混匀。从S6中吸取500 µL到第二个离心管S5中，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。S0为细胞培养基。
4. 1×检测抗体配制：检测抗体短暂离心，用稀释液A按照1:100倍稀释至工作浓度。混匀制成1×检测抗体工作液，临用前配制。
5. 1×SA-HRP配制：SA-HRP短暂离心，用稀释液B按照1:100倍稀释至工作浓度。混匀制成1×SA-HRP工作液，临用前配制。
注意：
1. 未开封的试剂盒：未拆封的试剂盒可整盒保存于4℃，有效期12个月。
2. 已开封的试剂盒：有效期4周，冻干标准品溶解后不能再次使用，剩余试剂及时放置4℃保存。此外，请将未使用的板条用包含干燥剂的铝箔袋装好，并拉紧密封铝箔袋，置于4℃保存。
操作步骤
1. 加样：分别设标准孔、待测样本孔、空白孔。用稀释液A稀释标准品及样本，设标准孔7孔（S1-S7），每孔依次加入100 μL不同浓度的标准品，空白孔每孔加入100 μL稀释液A，余孔每孔加入待测样品100 μL；
2. 加检测抗体：用稀释液A将检测抗体稀释至工作浓度，每孔加检测抗体50 μL。封板膜封板，100-300 rpm振荡（保证每孔溶液不洒出且能充分混匀即可），室温振荡孵育2小时；
注意：
1.步骤1和2尽快完成，前后间隔不超过10min，步骤顺序不能调换。
2.请先查阅相关文献确定样本中待检测蛋白的大致浓度，如果该浓度大于或者小于本试剂盒的最高或者最低标准品浓度，请进行适当稀释或浓缩后再检测。
3. 洗板：自动洗板或手工洗板，每孔洗涤液为300 μL，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将酶标板倒扣在吸水纸上适当用力拍干，弃去孔内液体；
4. 加SA-HRP：用稀释液B将SA-HRP稀释至工作浓度，每孔加1×SA-HRP工作液（临用前配制）100 μL，更换新的封板膜封板，100-300 rpm振荡（保证每孔溶液不洒出且能充分混匀即可），室温振荡孵育30分钟；
5. 洗板：重复步骤3；
6. 加显色液TMB：每孔加TMB底物溶液90 μL，更换新的封板膜，室温避光显色（反应时间应控制在10-30分钟，不要超过30分钟。当标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）；
7. 加终止液：每孔加终止溶液50 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不均一情况，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀；
8. 读数：在确保酶标板底部无水滴及孔内无气泡后，10分钟内用检测波长450 nm读值。推荐用双波长即检测波长450 nm、参考波长或校正波长630 nm同时读值，仅使用450 nm读值会降低准确度。
注意事项
1. 试剂盒按说明书保存，使用前室温平衡20-30分钟。
2. 标准品为冻干粉，所需加入的稀释液体积及稀释倍数，请严格按照试剂盒说明书进行操作。为保证标准品的精确性，标准品配制使用后，如果有剩余请勿再次使用。
3. 25×洗液在低温下可能有结晶，如果发现有结晶，请37℃温育使结晶完全溶解后再配制成工作液。
4. TMB对人体有刺激性，操作时请注意适当防护，避免试剂直接接触皮肤和眼睛。如不慎接触，请立即用大量清水清洗。
5. 试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作时请注意适当防护，避免试剂直接接触皮肤和眼睛。如不慎接触，请立即用大量清水清洗。
6. 如果发现显色液TMB出现混浊或颜色变成蓝色，请立即停止使用。
7. 不宜混用不同批号的试剂盒组份，每批次试剂盒均经过独立测试，不能混用。
8. 本试剂盒的操作在室温进行，要求严格控制室温在25-28℃。温度低于25℃会导致最终检测到的吸光度显著下降。
9. 检测标准品和样品时建议设置重复孔，以确保检测结果的可信度。
10. 在试剂盒的贮存或孵育过程中请避免强光照射。
11. 加样过程中需避免气泡的产生。
12. 在操作试剂盒或处理样本时请穿实验服，佩戴乳胶或一次性手套。
13. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅。
14. 为了避免微生物的污染及试剂与样本间的交叉污染，加样时请注意每个样品或标准品必须更换枪头。
15. 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，滤纸上看不到水印。勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。
结果分析
1. 结果计算
为了获得更准确的实验结果，建议标准品及样本进行复孔检测。计算标准品和样本的平均OD值，然后减去空白孔的OD值。
以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用计算机软件进行回归拟合生成标准曲线，相关系数R值越接近1，拟合效果越好。回归分析确定最佳拟合曲线。
代入样本检测OD值，计算出样本浓度，若样本进行了稀释，应乘以稀释倍数，即为样本的实际浓度。
通过对浓度值和OD值取对数拟合，可以对标准曲线进行线性化。此过程可能可以得到更多样本的浓度，但数据的准确度会降低。
2. 典型数据
每次检测每块酶标板都必须设立单独的标准曲线。由于实验操作条件的不同（如操作者、洗板条件和温度条件等），每次实验标准曲线的OD值会有所差异。说明书提供的标准曲线仅供参考。
检测步骤概要
1. 实验前按说明书准备标准品、试剂及样本；
2. 加样（标准品或样本）100 μL/孔，检测抗体50 μL/孔，室温振荡2小时；
3. 洗涤5次后拍干，加SA-HRP工作液100 μL/孔，室温振荡30分钟；
4. 洗涤5次后拍干，加TMB底物90 μL/孔，室温避光孵育10－30分钟；
5. 加终止液50 μL/孔；
6. 10分钟内于450 nm波长处检测OD值，参考波长630 nm。
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