首页 ꄲ 实验试剂 ꄲ 核酸、蛋白电泳试剂类 ꄲ 核酸提取试剂 ꄲ 动物组织/细胞总RNA提取试剂盒

产品介绍

产品简介

本试剂盒是用于从动物组织和细胞样本中经柱式法提取纯化RNA的广谱型试剂盒。试剂盒采用了特别的裂解缓冲系统，无需苯酚、氯仿等有机试剂抽提，并分别经过gDNA Eraser Spin Column（去除基因组DNA）以及RNA Spin Column（结合RNA），可从5-20 mg的动物组织、106-107新鲜培养的细胞中快速提取高纯度的RNA，整个提取过程仅需30 min即可完成。获得的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、Real Time RT-PCR和构建cDNA文库等各种分子生物学实验。

储存与运输

Proteinase K，DNase，DTT Solution冰袋（wet ice）运输，-20℃储存；其他试剂室温运输，室温储存；有效期12个月。

使用前准备

1. Buffer RL1如有沉淀现象，请于37℃加热溶解，待恢复至室温后使用。
2. 操作前请向Buffer RL1加入DTT Solution，至终浓度为4%，即1 mL Buffer RL1加入40 µL DTT Solution。此裂解液最好现配现用，加入DTT Solution的Buffer RL1可在4℃放置一个月。
3. 使用前请向Buffer RW1和Buffer RW2中加入指定量（见瓶身）的无水乙醇。
4. 按照提取样本量提前配制60%异丙醇（现配现用）。
5. 使用研磨仪研磨组织时，将研磨仪提前预冷。

操作步骤

1. 样本裂解：
a. 动物组织：取新鲜、超低温冻存或组织RNA稳定保存液（推荐G3019）保存的动物组织5-20 mg，置于装有2-3颗3 mm研磨珠（推荐G0203-150G）的1.5 mL RNase-free离心管或专用研磨管中，立即加入500 μL Buffer RL1（使用前请确认已加入DTT Solution），使用组织研磨仪（推荐KZ-5F-3D）在低温条件下将组织彻底研磨至匀浆状（如果组织没有被彻底匀浆，将会影响RNA的得率和质量），再加入10 µL Proteinase K，混匀后56℃孵育10-15 min，12,000 rpm，4℃离心5 min。
b. 悬浮培养细胞：将悬浮培养的细胞连同培养液一起倒入1.5 mL RNase-free离心管中，1,000 rpm离心5 min，收集悬浮培养的细胞（106-107），轻轻吸弃上清，向细胞沉淀中加入500 μL Buffer RL1（使用前请确认已加入DTT Solution），用移液器反复吹打均匀至无明显沉淀，再加入10 µL Proteinase K，混匀后56℃孵育10-15 min，12,000 rpm，4℃离心5 min。
c. 贴壁培养细胞：倒出培养液，用1×PBS（pH 7.4）清洗一次。向培养细胞中加入适量的Buffer RL1（使用前请确认已加入DTT Solution）,水平放置培养皿，使裂解液均匀的分布在细胞表面并裂解细胞，然后使用移液器轻轻吹打，使细胞完全脱落，分别转移500 μL含有细胞的裂解液至1.5 mL RNase-free离心管中，再加入10 µL Proteinase K，混匀后56℃孵育15 min，12,000 rpm，4℃离心5 min。
2. 将第一步的动物组织或细胞裂解液上清转移至gDNA Eraser Spin Column中（避免吸取沉淀），12,000 rpm，室温离心1 min；
3. 弃掉gDNA Eraser Spin Column，保留Collection Tube中的滤液；
4. 向上述步骤的滤液中加入等体积的60%异丙醇（此时可能会出现沉淀），用移液器吹打混匀；
5. 立即将混合液（含沉淀）全部转移至RNA Spin Column中，每次加入量不超过600 µL，如果超过600 µL可分批加入；
6. 12,000 rpm，室温离心30 s，弃掉废液，将RNA Spin Column重新放回Collection Tube中；
7. 向RNA Spin Column中加入500 μL Buffer RW1，12,000 rpm，室温离心30 s，弃掉废液；
8. 向RNA Spin Column中加入600 μL Buffer RW2（请沿RNA Spin Column管壁加入Buffer RW2，有助于冲洗管壁上残留的盐分），12,000 rpm，室温离心30 s，弃掉废液；
9. DNase消化（可选择）：本试剂盒中的试剂和gDNA Eraser Spin Column可以有效地去除大部分的基因组DNA，提取的RNA很少含基因组DNA。对于部分基因组DNA含量较高的组织（如肝脏、肾、脾等）或后续实验对RNA纯度要求比较严格，可以选择性地在RNA Spin Column吸附柱膜上进行DNase消化；
a) DNase反应液的配制：取5 µL 10×DNase Buffer，5 µL DNase，40 µL Nuclease-free Water于一新的1.5 mL RNase-free离心管中混匀；
b) 向RNA Spin Column中央加入50 μL DNase反应液，室温静置15 min；
c) 向RNA Spin Column吸附柱中加入500 μL Buffer RW2，12,000 rpm，室温离心30 s，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中；
10. 重复操作步骤8；
11. 将RNA Spin Column放入Collection Tube中，12,000 rpm，室温离心2 min，除去残留的液体；
12. 将RNA Spin Column置于一新的1.5 mL RNase-free离心管中，室温放置3-5 min，使RNA Spin Column残留的乙醇完全挥发；
13. 向RNA Spin Column的膜中央加入50-100 μL Nuclease-free Water，室温静置5 min，12,000 rpm，室温离心2 min洗脱RNA。若要得到更高浓度的RNA，也可以将第一次的洗脱液重新加回至RNA Spin Column中，室温静置5 min，12,000 rpm，室温离心2 min，再次收集RNA。

注意事项

1. 操作之前，请务必认真阅读本产品说明书。
2. 使用新鲜的组织或培养细胞进行提取。若组织或细胞需要长期保存，建议使用RNAsolid组织RNA稳定保存液（推荐G3019），可迅速抑制RNase并稳定保存样本中的RNA。
3. 实验时穿实验服，戴一次性手套，佩戴口罩，避免讲话，使用无RNase的枪头、离心管避免交叉污染。
4. 应使用RNA提取专用操作实验台与电泳设备。

附表：

本试剂盒对不同组织以及细胞的总RNA提取量见下表，组织或细胞的总RNA提取量与其新鲜程度或生长状态有关，下表仅供参考。